Вторник, 27 сентября, 2022

CRISPR-Cas9: как бактерии подсказали генетикам новую технологию

Время на чтение 7 мин.

В конце 1980-х Франсиско Мохика был аспирантом испанского Университета Аликанте. Он изучал архей — одноклеточные безъядерные организмы — которые обитали в солончаке неподалеку от города. В ядре этих клеток Мохика обнаружил странные последовательности ДНК: уникальные фрагменты длиной порядка 30 нуклеотидов разделялись повторяющимися участками такого же размера. На тот момент никто не понимал, зачем это нужно, но впоследствии оказалось, что это открытие стало первым кирпичиком в фундамент технологии, которая, вполне вероятно, изменит наш мир.

Что не убивает бактерию, делает ее сильнее

Позже CRISPR — Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeats — были обнаружены в ДНК и других архей и бактерий. Разобраться в природе явления помог GenBank. Это база данных, в которую загружается информация о последовательностях ДНК и РНК, а также о белках, которые они кодируют. Сейчас в ней описано почти 300 миллионов последовательностей. Но и тех, которые там находились в 2002 году, было достаточно, чтобы выяснить: участки CRISPR содержат ДНК бактериофагов.

Бактериофаги — это вирусы, которые поражают одноклеточные организмы. Прикрепляясь к мембранам, бактериофаги вводят в клетку частицы своей ДНК. Те встраиваются в ДНК бактерии-хозяина и заставляют его производить белки, нужные для строительства новых вирусов. В конце концов, инфицированные организм погибает, а новенькие бактериофаги выходят на охоту за следующими.

Но, разумеется, бывают бактерии, которые оказываются сильнее вируса и выходят из этой смертельной схватки победителями. Они не просто выживают, а еще и встраивают частицу вирусной ДНК в свою — это и есть CRISPR. К нему прикреплен специальный белок Cas (CRISPR associated protein). Вместе эта система анализирует любую ДНК, находящуюся внутри бактерии. И если оказывается, что она аналогична CRISPR, то белок Cas делает чик-чик: просто вырезает эту последовательность. Не в силах перенести подобную операцию, чужеродная ДНК распадается, и инфицирования не происходит.

Таким образом, CRISPR-Cas9 (цифра 9 означает разновидность белка) отвечает за адаптивный иммунитет бактерий и архей. Если одноклеточный организм встретился с бактериофагом, но выжил, он «нарезает» ДНК вируса на кусочки и встраивает в собственную. И когда в следующий раз бактерию атакует такой бактериофаг, она насылает на него CRISPR-Cas9.

Франсиско Мохика описал назначение CRISPR в статье еще в 2003 году, но два года не мог ее опубликовать — авторитетные научные журнала, включая Nature, отклоняли ее. Лишь в начале 2005-го статья вышла в Journal of Molecular Evolution.

Это любую ДНК так можно?

Изучение CRISPR-Cas9 продолжалось, биологи прояснили не только назначение этой системы, но и механизм ее работы в живой природе. В частности, в этой области работали Эмманюэль Шарпантье и Дженнифер Даудна, которые в 2020 году стали лауретками Нобелевской премии по химии. Разговорившись однажды в кулуарах научной конференции в Коста-Рике, ученые задались вопросом: а можно ли CRISPR-Cas9 приспособить для работы с любой последовательностью ДНК? Объединив усилия своих лабораторий, исследовательницы выяснили, что да. И таким образом стали первооткрывательницами технологии редактирования генов с помощью CRISPR-Cas9.

В целом, технология не слишком сложна. Мы берем последовательность нуклеотидов из целевого гена, соединяем ее с белком Cas и запускаем в клетку. Система находит эту последовательность и разрезает ДНК — все как в случае с вирусными частицами, но с одним исключением. ДНК более сложных организмов (включая человека) может восстанавливать разрывы. Однако ген, в котором был сделан этот разрыв, больше не может функционировать. Таким образом в целом организм продолжает функционировать, но конкретный ген в нем работать перестает. Этот процесс называется нокаутом гена.

Найти и заменить

Но что, если нам надо не «выключить» ген, а отредактировать его? Допустим, в нем случайно возникла мутация, которая привела к неработоспособности или неправильному функционированию, и мы хотим исправить эту ошибку. Здесь на помощь приходит технология Magestic — Multiplexed Accurate Genome Editing with Short, Trackable, Integrated Cellular barcodes, статья о которой была опубликована в Nature Biotechnology.

Дело в том, что, когда ДНК пытается самостоятельно ликвидировать разрыв, это чаще всего происходит с ошибками. Она может что-то потерять или наоборот, вставить лишнее. В итоге ген все равно не будет кодировать белок, как нужно. Чтобы этого избежать, нужно вовремя «подсунуть» ДНК нужный фрагмент — тогда она пойдет по пути наименьшего сопротивления и вставит его. Технология Magestic как раз и позволяет прикрепить к CRISPR-Cas9 такой фрагмент. Вся система работает как функция «Найти и заменить» в Word. Мы задаем фрагмент ДНК, который нужно найти, задаем фрагмент на замену — и запускаем процесс.

И этот механизм работает на любом организме, включая млекопитающих и человека. Разумеется, нам не нужно возиться с каждой клеткой по отдельности. Систему редактирования можно доставлять в клетки при помощи аденоассоциированных вирусов — примерно так же, как в природе происходит обмен между бактериофагами и одноклеточными. Однако аденоассоциированные вирусы, возможно, связаны с риском развития мужского бесплодия, поэтому разрабатываются более надежные варианты, например, липидные наночастицы в которых система заключается как бы в капсулу, покрытую липидами. После того как дело сделано, капсула просто растворяется.

Лечение и наказание

Технология CRISPR-Cas9 настолько проста, что купить реактивы для нее может любой желающий — они свободно продаются на специализированных сайтах. При наличии минимально оборудованной лаборатории можно начинать свои эксперименты.

Разумеется, наибольший интерес CRISPR-Cas9 вызывает в контексте биомедицины. Технология открывает путь к простому и эффективному лечению генетических заболеваний, которые сейчас неизлечимы. Уже успешно опробована на человеке методика лечения бета-талассемии и серповидно-клеточной анемии с помощью CRISPR-Cas9.

Оба заболевания вызываются мутацией в гене, отвечающий за кодирование бета-гемоглобина. С помощью CRISPR-Cas9 ученые выключили этот ген и включили другой, кодирующий фетальный гемоглобин (в норме он производится только у младенцев, а у взрослых этот ген не работает). Чтобы произвести процедуру, у пациенток изъяли клетки костного мозга, провели в них генетическое редактирование, и ввели измененные клетки обратно. В результате пациентке с бета-талассемией перестали требоваться постоянные переливания крови, а пациентка с серповидно-клеточной анемией перестала страдать от закупорки сосудов.

Если пойти дальше, то изменения в гены можно вносить еще до рождения, получая генно-модифицированных людей. Такой опыт был проведен китайским биологом Хэ Цзянькуем в 2018 году. Проводя искусственное оплодотворение, он изменил ген будущих девочек-близняшек так, чтобы они стали невосприимчивы к ВИЧ. В природе такие люди встречаются — у них действительно есть мутация гена CCR5, которая делает их невосприимчивыми к вирусу. Однако опыт обернулся грандиозным скандалом. Университет, в котором работал Цзянькуй, заявил, что не имеет к эксперименту отношения. Оказалось, что документы, разрешающие опыт, были подделаны, а пациенты не знали, что им имплантируют генно-модифицированные эмбрионы. В результате Цзянькуй получил три года тюрьмы и штраф три миллиона юаней.

Генетическое редактирование, особенно человека, вероятно будет одной из самых дискутируемых с этической точки зрения тем в ближайшие десятилетия. Об этом можно судить хотя бы потому, что споры вокруг ГМО-продуктов не утихают, хотя они существуют уже несколько десятилетий и прошли, наверное, тысячи исследований, доказывающих их безвредность.

Изображение на превью — Cancer cell photo created by kjpargeter — www.freepik.com

Оставьте ответ

Пожалуйста, введите свой комментарий!
Пожалуйста, введите ваше имя здесь

Enter Captcha Here : *

Reload Image